Диссертация - Разработка подходов для переноса и реализации чужеродной генетической информации |
Содержание |
ОГЛАВЛЕНИЕ
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 9
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16 1.1. МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ДНК ЖИВОТНЫХ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ОБЪЕКТ ДЛЯ СОЗДАНИЯ
ЧЕЛНОЧНЫХ ВЕКТОРОВ 16 1.1.1. СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО
ГЕНОМА 16
Организация мтДНК 16 Число молекул мтДНК в клетках животных. Феномен
гетероплазмии 17
Наследование мтДНК 18
Организация мтДНК в клетке 19
Тонкая структура мтДНК 20
Структура Н-цепи мтДНК 23
Структура L-цепи мтДНК 25
Митохондриальный генетический код 26 Видовые особенности организации митохондриальных
геномов 27
Репликация мтДНК животных 28
Инициация репликации Н-цепи мтДНК 28 Ферменты, принимающие участие в инициации
репликации мтДНК 30
Инициация синтеза L-цепи мтДНК 31 Trans-активирующие факторы, принимающие участие в
росте и созревании вновь синтезированных цепей ДНК 32
ЭКСПРЕССИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА 34
Транскрипция мтДНК 34
1.1.2.1.1. Ферменты и некоторые факторы, обеспечивающие транскрипцию мтДНК 35
1.1.2.1.2. Инициация транскрипции мтДНК 37
1.1.2.1.3. Процессинг первичного транскрипта мтДНК 39
1.1.2.1.4. Дифференциальная экспрессия митохондриальных генов 40
1.1.1.1.
1.1.1.2.
1.1.1.3.
1.1.1.4.
1.1.1.5.
1.1.1.5. .1.
1.1.1.5. ,2.
1.1.1.5. .3.
1.1.1.6.
1.1.1.7
1.1.1.7 .1.
1117 1 1
1.1.1.7 .2.
1.1.1.7 .3.
1.1.2.
1.1.2.1 .
11?! 1
1.1.2.2. Биосинтез белков в митохондриях 41
1.1.2.2.1. Особенности трансляции в митохондриях 41
1.1.2.2.2. Митохондриальные факторы трансляции 43
1.1.2.3. Митохондриальные болезни 44 1.1.2.3.1. Создание моделей для изучения некоторых
митохондриальных патологий 46 1. 2. СИСТЕМЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ПЕРЕНОС И РЕАЛИЗАЦИЮ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В
КЛЕТКАХ ЖИВОТНЫХ 48
1.2.1. ЧЕЛНОЧНЫЕ ВЕКТОРЫ 48
1.2.1.1. Векторы для межродового переноса ДНК у бактерий 49
1.2.1.2. Векторы для клонирования ДНК в системе бактерии-дрожжи 50
1.2.1.2.1. Векторы типа Yip 51
1.2.1.2.2. Векторы типа Yep 51
1.2.1.2.3. Векторы типа Yrp 52
1.2.1.2.4. Векторы типа Yep 52
1.2.1.2.5. Векторы типа YAC 53
1.2.1.3. Челночные векторы для системы клетки Е. coli - клетки животных 54
1.2.1.3.1. Репликон вируса SV40 54
1.2.1.3.2. Репликон вируса папилломы быка (BPV) 55
1.2.1.3.3. Репликон вируса Эпштейна-Барр (ЕВV) 56
1.2.1.3.4. Векторы на основе ретровирусов 57
1.2.1.3.5. Аденовирусные векторы 5 9
1.2.2. ТРАНСФОРМАЦИЯ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК И СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ ГЕНОВ 61
1.2.2.1. Основные методы трансформации животных клеток 62
1.2.2.1.1. Кальций фосфатный метод 62
1.2.2.1.2. Электропорация 63
1.2.2.1.3. Баллистическая трансфекция 64
1.2.2.1.4. Трансфекция с помощью вирусных векторов 65
1.2.2.1.5. Искусственные макромолекулярные системы трансфекции 66
1.2.2.2. Системы доставки чужеродной ДНК, используемые
в генной терапии 66
1.2.2.3. Введение генов в половые клетки. Получение трансгенных животных 68
2. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ 70
2.1. МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ДНК - ВОЗМОЖНЫЙ
ВЕКТОР ДЛЯ ПЕРЕНОСА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ 70
2.1.1. Материалы и методы 71
2.1.1.1. Материалы 71
2.1.1.2. Методы 71
2.1.1.2.1. Выделение митохондриальной ДНК из печени крысы 71
2.1.1.2.2. Мечение фрагментов ДНК изотопом I 73
2.1.1.2.3. Трансформация клеток Sacharomyces cerevisiae 74 II. 1.2. Исследование активности митохондриального
репликона в бактериальной системе при наличии плазмидного репликона 74
2.1.2.1. Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих фрагмент мтДНК крысы и ДНК плазмиды рВЮ22 75
2.1.2.2. Трансформация клеток Е. coli polAl и ро1А6 ДНК pBR-MtB-A 77
2.1.2.3. Трансформация клеток Е. coli polA12 (ts-мутанты KS55)
ДНК pBR-MtB-A 80
2.1.2.4. Исследование сохранения вставки мтДНК крысы в клетках Е. coli штаммов polA, трансформированных
ДНК pBR-MtB-A 82
2.1.2. Изучение функционирования рекомбинантных плазмид на основе мтДНК в бактериальных клетках при отсутствии плазмидного репликона 88
2.1.3.1. Конструирование рекомбинантной ДНК рмтКС, содержащей фрагмент мтДНК крысы и бактериальный ген устойчивости к канамицину 88
2.1.3.2. Анализ структуры рекомбинантной плазмиды pmtKC 1 90
2.1.4. Перенос бактериальных генов устойчивости к антибиотикам рекомбинантными плазмидами на
основе мтДНК крысы 94
2.1.5. Изучение экспрессии некоторых продуктов мтДНК при клонировании фрагментов мтДНК в клетках бактерий 97
2.1.5.1. Синтез полипептидных цепей цитохромоксидазы крысы в
клетках Escherichia coli 97
2.1.5.2. Экспрессия гена апоцитохрома b крысы в клетках Escherichia coli 104
2.1.6. Создание векторов для низших эукариотов (дрожжей) на основе фрагментов мт ДНК крысы 110
2.1.6.1. Конструирование ДНК pYMt 1, содержащей фрагмент мтДНК крысы и дрожжевой ген 1еи2 110
2.1.6.2. Функционирование ДНК pYMtl в дрожжевых клетках 112
2.1.6.3. Стабильность ДНК pYMtl в клетках дрожжей 114 2.2. ПЕРЕНОС ЧУЖЕРОДНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
ИНФОРМАЦИИ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 122 2.2.1. Перенос чужеродной ДНК в соматические клетки
ивотных 122
2.2.1.1 Материалы и методы 123
2.2.1.1.1. Материалы 123
2.2.1.1.2. Методы 124
2.2.1.1.2.1. Трансформация ККМ методом кальций фосфатной преципитации и культивирование трансформированных клеток 124
2.2.1.1.2.2. Выявление ККМ, трансфецированных плазмидной ДНК 125
2.2.1.1.2.3. Обнаружение Т-антигена вируса SV40 в трансфецированных ККМ 126
2.2.1.1.2.4. Определение активности тимидинкиназы вируса герпеса
в трансформированных ККМ 126
2.2.1.1.2.5. Определение тимидина в биологической пробе 127
2.2.1.1.2.6. Выявление клеточной и вирусной тимидинкиазы в
клетках селезенки трансгенных мышей 128
2.2.1.2. Трансформация клеток костного мозга грызунов рекомбинантной плазмидой pBRSV 129
2.2.1.2.1. Эффективность трансформации ККМ плазмидной ДНК
и стабильность трансформированных клеток 129
2.2.1.2.2. Исследование функциональной активности плазмидной
ДНК в трансформированных клетках 133
2.2.1.3. Доминантная селекция тимидином трансформированных клеток костного мозга животных 137
2.2.1.3.1. Выявление in vitro ККМ, содержащих ген тимидинкиназы вируса герпеса, при
доминантной селекции тимидином 137
2.2.1.3.2. Выявление in vivo ККМ, содержащих ген тимидинкиназы вируса герпеса, при доминантной
селекции тимидином 139
2.2.2. Перенос чужеродной генетической информации в
половые клетки животных 144
2.2.2.1. Материалы и методы 144
2.2.2.1.1. Материалы 144
2.2.2.1.2. Методы 145
2.2.2.1.2.1. Трансфекция плазмидной ДНК в клетки спермиев 145
2.2.2.1.2.2. Получение меченых радиоизотопами ДНК плазмид 145
2.2.2.1.2.3. Получение трансгенных животных 145
2.2.2.1.2.4. Анализ сыворотки крови трансгенных крыс 146
2.2.2.1. Исследование возможности введения чужеродной
ДНК в половые клетки самцов мышей 146
2.2.2.1.1. Получение сперматозоидов и введение в них
чужеродной ДНК 146
2.2.2.1.2. Введение в сперматозоиды плазмидной ДНК, адсорбированной на Са-Р - кристаллах. 147
2.2.2.1.3. Обсуждение полученных данных в
свете возможности использования спермиев для
целевой доставки чужеродных генов 151
2.2.2.2. Перенос генетической информации в яйцеклетку животных. Экспрессия гена а-1-антитрипсина (ААТ)
человека у трансгенных крыс 158
2.2.2.2.1. Создание рекомбинантных ДЬЖ, содержащих последовательности полноразмерной ААТ-кДНК
человека 160
2.2.2.2.2. Экспрессия а-1-антитрипсина человека у трансгенных
крыс 162
2.2.2.2.3. Анализ потомства на содержание последовательностей
кДНК ААТ человека 163
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 168
ВЫВОДЫ 180
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 182 |
Выдержки из работы |
|
|
|
Год |
Страниц |
Стоимость |
| 2002 |
182 |
290 рублей |
|
|
