Диссертация - Ферменты белкового обмена коконопрядущих насекомых
Содержание
2 ОГЛАВЛЕНИЕ
Оглавление...2
Список сокращений...10
Введение
Актуальность проблемы...12
Цель исследования...19
Задачи исследования...20
Научная новизна и теоретическая ценность диссертационной работы...21
Практическая значимость работы...23
Положения, выносимые на защиту...24
Апробация диссертационной работы...26
Структура и объём диссертации...26
Глава I. Ферменты, формирующие фонд свободных аминокислот насекомых (литературный обзор)...27
1.1. Ферменты аминокислотного обмена насекомых...27
1.1.1. Ферменты биосинтеза глицина...28
1.1.2. Ферменты биосинтеза серина...34
1.1.3. Ферменты биосинтеза аланина...37
1.1.4. Ферменты биосинтеза тирозина...47
1.2. Протеолитические ферменты насекомых...51
1.2.1. Внутриклеточные сериновые протеиназы...55
1.2.2. Внутриклеточные цистеиновые протеиназы...61
1.2.3. Внутриклеточные аспартатные протеиназы и металлопротеиназы..68
1.2.4. Белковые ингибиторы эндогенных протеиназ насекомых...72
Глава II. Материалы и методы...88
ИЛ. Материалы для изучения активности ферментов аминокислотного
обмена...88
И. 1.1. Приготовление препаратов исследуемых тканей коконопрядущих насекомых...88
3
И. 1.2. Приготовление препаратов грены тутового шелкопряда...89
II. 1.3. Определение ферментативной активности растворимых белков тканей и грены шелкопряда методом энзим-электрофореза в
полиакриламидном геле...91
II. 1.3.1. Получение ферментных экстрактов тканей...92
II. 1.3.2. Выявление активности отдельных ферментов...92
II. 1.3.3.Количественная обработка энзимограмм...97
II. 1.4. Определение активности ферментов аминокислотного обмена с
помощью автоматического анализатора аминокислот...97
П.1.4.1. Получение ферментных экстрактов тканей...99
II. 1.4.2. Выявление активности отдельных ферментов...100
II. 1.4.3. Количественное определение аминокислот с помощью
аминокислотного анализатора...101
И. 1.5. Определение ферментативной активности растворимых белков тканей и грены тутового шелкопряда колориметрическими и
спектрофотометрическими методами...104
П.2. Материалы и методы для изучения метаболизма 14С-меченых белков у
тутового шелкопряда...108
И.2.1. Биологический материал...108
И.2.2. Получение меченых белков тканей и органов тутового шелкопряда
и исследование их метаболизма...108
И.2.2.1. Введение радиоактивной аминокислоты в гемолимфу гусениц
тутового шелкопряда...108
П.2.2.2. Получение препарата меченых белков гемолимфы и введение его
гусеницам тутового шелкопряда...109
П.2.2.3. Получение и очистка препаратов растворимых и нерастворимых
белков из тканей и органов тутового шелкопряда...ПО
Н.2.2.4. Выделение фиброина и серицина из оболочки кокона тутового
шелкопряда...111
Н.2.2.5. Фракционирование растворимых белков методом диск-
4
электрофореза в полиакриламидном геле...111
П.2.2.6. Определение количественного содержания белков на
электрофореграммах...112
И.2.2.7. Просчёт радиоактивности белковых препаратов методом
отношения каналов...113
П.2.2.8. Просчёт радиоактивности белков, фракционированных методом
электрофореза в полиакриламидном геле...116
И.2.3. Выделение свободных аминокислот и определение уровня радиоактивности предшественника в тканях и органах тутового
шелкопряда...117
Н.2.4. Определение аминокислотного состава белков гемолимфы, разделённых методом диск-электрофореза в полиакриламидном
геле...118
П.2.4.1. Разработка метода элюции белков гемолимфы с колонок
полиакрил амидного геля...118
П.2.4.2. Определение аминокислотного состава белков гемолимфы с
помощью автоматического анализатора аминокислот...122
И.З. Материалы и методы для изучения активности протеолитических
ферментов и их белковых ингибиторов у тутового шелкопряда...123
И.З. 1. Материал...123
П.3.2. Получение препаратов растворимых белков из грены тутового
шелкопряда...125
11.3.3. Выделение субклеточных фракций из грены шелкопряда...125
И.3.4. Выделение ядер и хроматина из грены тутового шелкопряда...127
II.3.5. Методы изучения протеолитических ферментов у тутового
шелкопряда...129
И.З.5.1. Определение активности эндогенных пептидогидролаз в белковых экстрактах тканей, органов и грены тутового
шелкопряда...129
Н.3.5.2. Определение подклассовой принадлежности протеолитических
5
ферментов...131
И.3.6. Определение активности эндогенных ингибиторов протеолитических ферментов в гомогенатах и субклеточных фракциях грены тутового шелкопряда спектрофотометрическим
методом...131
П.3.7. Электрофоретическое фракционирование растворимых белков
грены тутового шелкопряда...135
II.3.8. Методы выделения и очистки ферментов белкового обмена
тутового шелкопряда...135
И.3.8.1. Гель-фильтрация...135
И.3.8.2. Ионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе...136
П.3.8.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография...136
И.3.8.4. Хроматография белков на оксиапатите...137
П.3.8.5. Изоэлектрофокусирование в градиенте плотности сахарозы
(рН4-6)...138
И.3.8.6. Препаративное изоэлектрофокусирование в слое
ультродекса...139
И.3.8.7. Аффинная хроматография...140
И.3.9. Методы изучения физико-химических характеристик ферментов
белкового обмена тутового шелкопряда...142
И.3.9.1. Методы определения молекулярной массы ферментов белкового
обмена...142
И.3.9.1.1. Определение молекулярной массы ферментов белкового
обмена тутового шелкопряда методом гель-фильтрации...142
Н.3.9.1.2. Определение молекулярной массы ферментов белкового
обмена методом электрофореза в полиакриламидном геле.. 142
Н.3.9.2. Определение изоэлектрических точек ферментов белкового
обмена методом аналитического изоэлектрофокусирования в
тонком слое полиакриламидного геля...144
II.3.9.3. Изучение субстратной специфичности ферментов белкового
6
обмена тутового шелкопряда...145
IL3.9.4. Определение констант Михаэлеса для субстратов прямой реакции, катализируемой аланинаминотрансферазой
шёлкоотделительной железы тутового шелкопряда...146
II.4. Статистическая обработка результатов эксперимента...147
Глава III. Ферменты синтеза глицина, аланина, серина и тирозина в тканях и органах коконопрядущих насекомых...149
III. 1. Пути синтеза главных аминокислот шёлка в шёлкоотделительной
железе тутового шелкопряда...149
Ш.2. Взаимосвязь процессов биосинтеза главных аминокислот шёлка в шёлкоотделительной железе с их обменом в других тканях тутового
шелкопряда...159
Ш.З. Сравнительная характеристика ферментов биосинтеза главных аминокислот шёлка коконопрядущих насекомых (Bombyx mori L., Antheraeapernyi G.-M. uActias artemnis B.)...171
111.4. Электрофоретическая гетерогенность некоторых ферментов аминокислотного обмена в тканях и органах коконопрядущих насекомых...180
111.5. Фазовая специфичность ферментов аминокислотного обмена насекомых. Ферменты аминокислотного обмена в эмбриогенезе тутового шелкопряда...186
Глава IV. Белковые компоненты тканей и органов тутового шелкопряда как источники азотистого материала для синтеза главных аминокислот шёлка...196
IV. 1. Взаимосвязь белкового обмена тканей и органов тутового
шелкопряда, выясненная на основании опытов по включению
2-14С-глицина в суммарные белки...197
IV.2. Взаимосвязь белкового обмена тканей и органов тутового шелкопряда, выясненная на основании опытов по включению в его организм 14С-белков гемолимфы...210
7
IV.3. Изучение роли в процессах шёлкообразования белковых фракций тканей и органов тутового шелкопряда, основанное на результатах
включения в их состав 2-14С-глицина...217
Глава V. Исследование протеолитических ферментов и их белковых
ингибиторов у тутового шелкопряда...240
V.l. Исследование протеолитических ферментов в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного
развития...240
V. 1.1. Динамика активности и характеристика пептидогидролаз в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе его
личиночного развития...241
V. 1.2. Активность эндогенного комплекса пептидогидролаз в тканях и органах тутового шелкопряда в связи с процессами
шёлкообразования...248
V.2. Исследование протеолитических ферментов и их белковых
ингибиторов в эмбриогенезе тутового шелкопряда...253
V.2Л. Гетерогенность эндогенного протеолитического комплекса в грене
тутового шелкопряда...254
V.2.2. Гетерогенность комплекса белковых ингибиторов пептидогидролаз
в грене тутового шелкопряда...260
V.2.3. Динамика протеолитических ферментов и их белковых
ингибиторов в эмбриогенезе тутового шелкопряда...262
V.2.4. Субклеточная локализация протеолитических ферментов и их
белковых ингибиторов в яйцах тутового шелкопряда...277
V.2.5. Протеолитические ферменты хроматина грены тутового
шелкопряда...291
Глава VI. Ферменты белкового обмена как маркеры продуктивности и
явления гетерозиса у тутового шелкопряда...300
VI. 1. Закономерности биосинтеза главных аминокислот шёлка в тканях и органах контрастных по продуктивности пород тутового
8
шелкопряда...301
VI.2. Активность аспартат- и аланинаминотрансферазы в тканях и органах пород и гибридов тутового шелкопряда и связь их с явлением
гетерозиса...303
VI.3. Ферменты аминокислотного обмена как маркеры продуктивности и явления гетерозиса на эмбриональной стадии развития тутового
шелкопряда...309
VI.3.1. Активность ферментов аминокислотного обмена в грене
различных по продуктивности пород тутового шелкопряда...310
VI.3.2. Активность ферментов аминокислотного обмена в грене
родительских пород и гибридов тутового шелкопряда...313
VI.4. Протеолитические ферменты и белковые ингибиторы пептидогидролаз как маркеры продуктивности и явления гетерозиса
в грене тутового шелкопряда...318
VI.4.1. Активность цистеиновых протеиназ и белковых ингибиторов папаина в грене различных по продуктивности пород тутового
шелкопряда...318
VI.4.2. Активность цистеиновых протеиназ в грене родительских пород и
гибридов тутового шелкопряда...322
Глава VII. Выделение и физико-химическая характеристика ряда ферментов белкового обмена из тканей и органов тутового
шелкопряда...329
VII. 1. Выделение и физико-химическая характеристика цитозольной аланинаминотрансферазы шёлкоотделительной железы тутового
шелкопряда...329
VII. 1.1. Разработка метода очистки аланинаминотрансферазы из
шёлкоотделительной железы тутового шелкопряда...330
VII. 1.2. Физико-химическая характеристика аланинаминотрансферазы.339
VII. 1.3. Сравнительная характеристика аланинаминотрансферазы,
выделенной из насекомых и из других биологических
9
объектов...347
VII.2. Выделение и характеристика протеиназы с оптимумом pH 3,0 из
грены тутового шелкопряда...356
VII.2.1. Очистка протеиназы с оптимумом pH 3,0 из грены тутового
шелкопряда...357
VII.2.2. Физико-химическая характеристика пептидогидролазы с
оптимумом pH 3,0 из грены тутового шелкопряда...363
VII.3. Выделение и характеристика пептидогидролазы с оптимумом pH 3,4
из хроматина грены тутового шелкопряда...371
VII.3.1. Очистка пептидогидролазы с оптимумом рНЗ,4 из хроматина
грены тутового шелкопряда...371
VII.3.2. Характеристика пептидогидролазы с оптимумом pH 3,4 хроматина
грены тутового шелкопряда...376
Заключение...379
Выводы...393
Практические рекомендации...397
Благодарности...398
Библиографический список...399
Приложение...463
